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辣根過氧化物酶用于ELISA的標記用酶HRP是一種分子量達44 000的糖蛋白，由無色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉結合而成，中性糖和氨基糖約占18％。每一個HRP分子中含一個氯化血紅素IX作輔基，該輔基在403nm波長處有zui大吸收峰，而去輔基的酶蛋白在275nm波長處有zui大吸收。HRP在403nm的OD值與275nm的OD值之比，也就是所謂的RZ（Reinheits Zahl）值。RZ值僅說明血紅素基團在HRP中的含量，并非表示HRP制劑的真正純度，而且RZ值高的HRP制劑，并不意味著酶活性也高。但可以一純酶溶液在10mm光徑403nm波長下的吸光度來計算酶濃度[1％（W／V）酶溶液吸光度為22．5，濃度為227umol／L]。純HRP干燥貯存于一200C可保持穩(wěn)定，使用1．36mol／L甘油、10mmol／L磷酸鈉、30umol／L牛血清白蛋白和20umol／L細胞色素C（pH 7．4）溶液作為基質冷凍保存，可使酶結合物穩(wěn)定數(shù)年。HRP對熱及有機溶劑的作用比較穩(wěn)定，用甲苯與石蠟切片處理或用純乙醇或lo％甲醛水溶液固定做冷凍切片，均不能使其活性改變。氰化物或硫化物在10-5～10-6mol／L濃度時具有可逆性地抑制HRP的作用；氟化物、疊氮化合物或羥胺僅在高于10-3mol／L濃度時抑制HRP；HRP還可被羥甲基過氧化氫不可逆地抑制。強酸也是HRP的強烈的抑制劑。因此，在酶免疫測定常選用上述的某些化合物如氟化鈉、疊氮鈉和強酸等作為酶反應的終止劑。此外，在配制酶免疫測定的稀釋緩沖液時，為防止酶失活，應避免使用疊氮鈉作防腐劑。HRP的同工酶主要可分為三種類型：①含糖量高的酸性同工酶。②等電點接近于中性（或微堿）的含糖量相對較低的同工酶。③含糖量低的堿性（PI>11）同工酶。酶免疫試驗中所使用的HRP，以PI為8．7～9．0的所謂“C”同工酶為主要組成成分，其他同工酶的活性則很低。“C”同工酶的共價結構由2個密切接近的區(qū)域組成，血紅素基團則位于其間而成夾心結構，糖鏈以8個不同的部位結合于多肽。天然的酶所帶的純電荷極少；無游離的。—氨基，僅有2個可測出的組氨酸，6個賴氨酸似乎全被糖鏈外殼所遮蓋。因此，HRP一般僅有1～2個可用于耦聯(lián)的氨基。根據(jù)HRP的催化特性，ELISA中一般使用過氧化氫（H2O2）作為HRP底物之一，在供氫體（即色原底物）存在時，HRP與H2O2的反應迅速而又專一。由圖4—1可見，HRP被H2O2二價地氧化形成復合物I，而復合物I又可與氫供體的二步連續(xù)的單價相互作用而還原至起始狀態(tài)。復合物Ⅱ是被氧化的帶一個電子的中間產物，當H2O2：過量，由于復合物Ⅲ或Ⅳ的形成，酶活性受抑制。30％的H2O2并不穩(wěn)定。由于H2O2既為HRP的底物，也為其抑制劑，因而ELISA要想得到滿意的測定結果，H2O2必須限定在一定的濃度范圍內，終濃度通常為2～6mmol／L。然而在實際研究工作中，一般很少注意這一點。大多數(shù)研究者所使用的H2O2的濃度常較理想反應所需的量大2～4倍。吸附于固相的HRP較游離的HRP更易受過量H2O2的抑制。如果30％H：O：貯存液濃度經(jīng)測定證實確為30％，則稀釋10 000—12 000倍常是較為理想的底物。H2O2的摩爾消光系數(shù)為10mm光徑240nm波長下為43．6，因此，可通過這種方式來檢測H2O2工作溶液的濃度。固相ELISA中，當溫度高于20~C時，HRP活性常較低，在底物溶液中加入非離子去垢劑聚山梨醇—20或TritonX-100可延遲HRP的失活，且可使反應溫度加大，但非離子去垢劑的這種酶活性保護效應依氫供體的不同而有差異。如以2，2’—聯(lián)氮—雙—[3—乙基苯并噻唑啉]—6—磺酸（ABTS）為氫供體，則只能保護20％的酶活性，而以鄰聯(lián)茴香胺（ODA）為氫供體時，酶活性的保護提高至90％。HRP之所以是迄今為止在ELISA中應用的標記用酶，主要是因為其一方面易于提取，價格相對低廉；另一方面性質穩(wěn)定，耐熱及有機溶劑的作用，與抗原或抗體耦聯(lián)后，活陛很少受損失。
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