孔雀石綠檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書（酶聯(lián)免疫法）

1 孔雀石綠檢測(cè)試劑盒原理及用途
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，同時(shí)把隱性孔雀石綠氧化成孔雀石綠，可檢測(cè)動(dòng)物組織和水樣中的孔雀石綠（Malachite Green，MG）總量。試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的孔雀石綠和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗孔雀石綠抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含孔雀石綠含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中孔雀石綠的殘留量。
2 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：37℃，10min～30min～30min～15min
2.3 檢測(cè)下限：
魚/蝦等水產(chǎn)品 ……………0.5ppb
水樣 …………………………0.1ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
顯性孔雀石綠………………………100%
結(jié)晶紫………………………………91%
隱性孔雀石綠（氧化后）…………100%
隱性結(jié)晶紫（氧化后）……………91%
 2.5 樣本回收率：
魚/蝦等水產(chǎn)品、水樣……………90%±10%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板………………………………96孔
10×標(biāo)準(zhǔn)品(棕色蓋)：各0.5ml
0ppb、0.5ppb、1ppb、2ppb、4ppb、8ppb
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(藍(lán)蓋)………………10ml
10×濃縮酶結(jié)合物…………………1.6ml
10×濃縮抗體……………………0.8ml
底物液A(白蓋)………………………7ml
底物液B(黑蓋)………………………7ml
終止液(黃蓋)………………………7ml
10X濃縮洗滌液(白蓋)……………50ml
樣本稀釋緩沖液(紅蓋）………………5ml
氧化劑(黑蓋)…………………………3ml
說(shuō)明書 ………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）、恒溫箱
4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?0µl-200µl、100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：乙腈、乙酸、二氯甲烷、無(wú)水硫酸鈉、中性氧化鋁、正己烷
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：樣本提取液
    首先將乙腈與二氯甲烷配成體積比為2:1混合液，然后向上述混合液中加入乙酸，使其終濃度約為1%，按需配制。（例：100ml 乙腈+50ml 二氯甲烷+1.5ml 乙酸。）
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 低脂肪含量樣品（羅非魚、鯽魚、鰱魚、鳙魚、草魚、蝦、鯉魚等）
1）魚蝦去皮取肉，用勻漿器均質(zhì)樣品；
2）稱取2g均質(zhì)好的樣品，放入50ml離心管中，加入10ml樣本提取液(配液1)，立即搖勻，加入1g無(wú)水硫酸鈉，充分震蕩10min，4000r/min 離心5 min；
3）取7ml上清移至50ml離心管中，加入20ul氧化劑，震蕩2min，加入7ml 正己烷，顛倒混勻1min，4000r/min離心5min。
4）取下層5ml，50-60℃下氮?dú)獯蹈伞＜尤?00ul 乙腈，渦旋使殘?jiān)芙猓ㄗ⒁馍w緊蓋防止乙腈揮發(fā)掉）。
5）測(cè)定時(shí)取上述乙腈溶解液25ul，加50ul樣本稀釋緩沖液，175μl 蒸餾水，混合均勻，取50ul分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：3     檢測(cè)下限：0.5ppb
5.3.2 高脂肪含量樣品（鰻魚、鯰魚等）
1）魚蝦去皮取肉，用勻漿器均質(zhì)樣品；
2）稱取2g均質(zhì)好的樣品，放入50ml離心管中，加入10ml樣本提取液(配液1)，立即搖勻，再加入1g中性氧化鋁、1g無(wú)水硫酸鈉，充分震蕩5min，4000r/min 離心5 min；
3）取7ml上清移至50ml離心管中，加入20ul氧化劑，震蕩2min，加入7ml 正己烷，顛倒混勻1min，4000r/min離心5 min。
4）棄去全部上層正己烷層（注：中間蛋白脂肪層需棄除），再加入7ml 正己烷，顛倒混勻1min，4000r/min 離心5min； 
5）取下層5ml，50-60℃下氮?dú)獯蹈?，加?00ul 乙腈，渦旋使殘?jiān)芙猓ㄗ⒁馍w緊蓋防止乙腈揮發(fā)掉）。
6）測(cè)定時(shí)取上述乙腈溶解液25ul，加50ul樣本稀釋緩沖液，175ul 蒸餾水，混合均勻，加入500ul正己烷渦旋2min，棄去全部上層正己烷，取下層50ul分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：3     檢測(cè)下限：0.5ppb
5.3.2水質(zhì)樣品
取水樣175ul, 加入50ul 樣本稀釋緩沖液, 25ul 乙腈，取50ul分析。 
樣本稀釋倍數(shù)：1.43    檢測(cè)下限：0.1ppb
注：此方法所得到的結(jié)果為孔雀石綠；隱性孔雀石綠；結(jié)晶紫；隱性結(jié)晶紫的總量。
6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前需：
配液A：洗滌工作液
將50ml 10×濃縮洗滌液用去離子水按1:9稀釋成500ml工作洗滌液備用。
配液B：活化劑工作液
將氧化劑按1:99體積進(jìn)行稀釋（現(xiàn)用現(xiàn)配，按需配制）
配液C：抗體工作液
用配液A（洗滌工作液）將10×濃縮抗體10倍稀釋（臨時(shí)用時(shí)，按需配制）
配液D：酶標(biāo)記物
用配液A（洗滌工作液）將10×濃縮酶結(jié)合物10倍稀釋（臨時(shí)用時(shí)，按需配制）
制備孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液：
標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0ppb，0.05ppb，0.1ppb，0.2ppb，0.4ppb，0.8ppb）
取6個(gè)1.5ml離心管，把標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋10倍（如：450ul標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液加入50ul 10×標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液）
6.1 編    號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 活化：加120ul活化劑工作液（配液B）到微孔中，室溫下反應(yīng)10min，倒掉拍干，加洗滌工作液（配液A）250ul/孔，洗滌5次，每次間隔30s，棄去孔中液體，在吸水紙上拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的吸頭戳破）。
6.3 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.4 洗    滌：將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液工作液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，zui后用吸水紙拍干。
6.5 加酶反應(yīng)：加酶標(biāo)記物100µl/孔，37℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.6洗    滌：同上
6.7 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光顯色15分鐘。
6.8 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.9 測(cè)吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm）。測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計(jì)算
    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝A×100%A0
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。
    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（索?。?br />8 注意事項(xiàng)
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性。
8.4 在所有孵育過(guò)程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒。